Nelle cellule in divisione la sintesi del DNA nucleare richiede precursori (i dNTP) prodotti nel citoplasma dalla via detta "de novo". Il DNA mitocondriale (mt) invece si replica anche nelle cellule differenziate in cui la sintesi de novo é spenta e i dNTP sono prodotti nei mitocondri da enzimi codificati da geni nucleari. Mutazioni in alcuni di questi geni destabilizzano il DNA mt, probabilmente per carenza di dNTP mt. Altre anomalie nella conservazione del DNA mt sono associate a difetti genetici in enzimi che degradano i dNTP nel citoplasma. In questo caso i mitocondri soffrirebbero di un eccesso di dNTP. I meccanismi per cui queste deficienze enzimatiche destabilizzano il DNA mt erano finora largamente ipotetici, in mancanza di metodi per studiare separatamente i dNTP nei mitocondri e nel resto della cellula. In una ricerca finanziata da Telethon, il nostro gruppo ha ideato e convalidato un metodo per distinguere il comportamento dei dNTP mt e citoplasmatici. Lo applicheremo allo studio delle anomalie causate da mutazioni delle due deossinucleoside chinasi mitocondriali, la TK2 e la dGK, e in due enzimi degradativi citoplasmatici, la timidina fosforilasi (TP) e la fosforilasi dei nucleosidi purinici (PNP). Tutte queste mutazioni causano gravi malattie mt umane: sindromi da deplezione del DNA mt (mutazioni in TK2 o dGK), MNGIE (TP) e immunodeficienza delle cellule T (PNP). Per bloccare la funzione di tali enzimi in cellule in coltura e mimare le mutazioni geniche presenti nei pazienti useremo la tecnica dell'interferenza con RNA. Con lo stesso sistema inattiveremo altre proteine implicate nel metabolismo dei dNTP mt. Scopo del nostro lavoro é ottenere un quadro dettagliato della normale regolazione dei dNTP mt e di come la deficienza di singoli enzimi possa destabilizzare il DNA mt e causare la malattia mt. I nostri studi potranno fornire metodi diagnostici per riconoscere le basi molecolari di malattie mt ancora non spiegate e suggerirne il trattamento.